НЕФТЬ-ГАЗ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
На главную >>


Теперь на нашем сайте можно за 5 минут создать свежий реферат или доклад

Скачать книгу целиком можно на сайте: www.nglib.ru.

Предложения в тексте с термином "Автор"

Авторы указывают также на то обстоятельство, что агароза — не всегда наиболее удачная матрица для очистки протеиназ, так как ее разрушают часто сопутствующие протеазам карбогидразы.

Авторы вели конденсацию.

Авторы предлагают метод спектрального определения количества белка (или НК), связанного с матрицей, посредством регистрации первой производной кривой поглощения света в диапазоне 250—350 нм [Schurz, Rudiger, 1982].

Воспользовавшись меченой ДНК, авторы работы [Moss et al.

Авторов особенно интересовала устойчивость связи ДНК с сорбентом.

По этой причине для ковалентного закрепления ДНК авторы выбрали последний из трех сорбентов.

Автор приводит методику пришивки ДНК УФ-облучением на се-фадекс G-10.

По утверждению автора, связывалось до 90% ДНК, что с учетом степени набухания сефадекса G-10 дает аффинный сорбент с концентрацией ДНК 2—3 мг/мл.

Аналогичный вариант электрофоретической элюции был использован другими авторами [Kincaid, Vaughan, 1979].

В данной работе авторы тонко манипулировали содержанием ионов Са2+ с целью очистки этого ингибитора.

Это позволило тем же авторам разработать метод очистки новосинтезированной вирусной ДНК из культуры зараженных вирусом SV-40 клеток почки зеленой обезьяны.

Из приведенной методики видно, что фермент не очень прочно связывался с красителем, поэтому автор воздержался от эффективных мер для удаления неспецифически сорбированного материала.

Аффинная хроматография на гепарин-сефарозе рекомендована авторами в качестве основной процедуры для очистки различных рестриктаз.

Авторы подробно описывают приготовление гепарин-сефарозы в лабораторных условиях.

Авторы предложили изящную методику получения аффинного сорбента, несущего вполне определенный фрагмент нативной ДНК.

Для посадки и элюции РНК-полимеразы авторы использовали иной буфер: 0,05 М Трис-HCl (рН 7,9) + 0,1 мМ ЭДТА + 0,1 мМ ДТТ + 5% глицерина.

Предложенная автором методика УФ-пришивки ДНК к сефадексу G-10 рассмотрена выше.

500 мл концентрированного экстракта из сердца быка (120 мг белка в 1 мл) авторы медленно пропускали через колонку с упомянутым сорбентом.

Авторы умело использовали то обстоятельство, что два очищаемых фермента обладают значительно большим сродством к данному сорбенту, чем все остальные ферменты той же группы.

Заметим, что в предшествующей работе с участием того же автора [Lee, Johansson, 1977] было показано, что в точном соответствии с характером присоединения фосфатов к аденозину сефарозные сорбенты, несущие на конце шестичленного гидрофобного спейсера АТР, хорошо связывают дегидрогеназы и киназы, зависящие от НАД, а сорбенты, несущие 2',5'-ADP,— дегидрогеназы и другие ферменты, зависящие от НАДФ.

Вместе с предварительной 6-кратной очисткой цитозоля осаждением сульфатом аммония это позволило авторам получить гомогенный препарат рецептора [Smith et al.

Автору удалось использовать этот прием для элюции с аффинного сорбента.

Затем ими иммунизировали кролика, получали антисыворотку, фиксировали ее на сефарозе и тем самым образовывали второй иммуносорбент, специфичный ко всей совокупности примесных белков; авторы назвали его «обратным иммуносорбентом» («reverse immunoadsorbent»).

Полнота меркурирования, по данным этих авторов,— более 98%.

Авторы отмечают, что аналогичные задачи решались путем гибридизации с ЫК, сорбированными на целлюлозе.

Авторы отмечают, что поры агарозной матрицы продажного «Affi-Gel 501» недостаточно велики, так что молекулы РНК, более крупные, чем 5S РНК, проникают в них с трудом.

Эти авторы перед началом синтеза РНК ввели дополнительный этап: инкубационную смесь, содержавшую ATP-^-S и три обычных трифосфата, предварительно выдерживали в течение часа при 0°.

Основанием для разработки этого метода послужили ранее опубликованные данные авторов о том, что указанные белки преимущественно связываются именно с активными нуклеосома-ми, повышая их чувствительность к обработке ДНКазой I.

В данном случае авторы решали обратную задачу.

Она содержит длинную поли(А)-последовательность (по оценке авторов — примерно 200 нуклеотидов), часть которой закрыта полиуридиловой последовательностью в 20—50 звеньев.

Кроме того, для аналитической очистки мРНК авторы предложили предварительно пропускать через колонку раствор тРНК для насыщения центров прочной неспецифической сорбции РНК на целлюлозе.

С помощью такого сорбента авторы добивались обогащения ядерной ДНК из Dictyostelium discoideum фракцией рибосомальных генов.

В следующей публикации тех же авторов даны некоторые усовершенствования описанного метода fSturnph et al.

Авторы сопоставили несколько способов ковалентного закрепления антител на агарозной матрице.

Авторы использовали обычные пластинки размером 20 X 20 см, покрытые слоем микрокристаллической целлюлозы толщиной 0,2 мм.

По данным авторов, удавалось обнаруживать пятна, содержавшие 0,05 нмоль аминокислоты.

Схема сконструированного автором простейшего приборчика для электрофореза на ТСХ-пластинке показана на рис.

Мы довольно подробно рассмотрели эту работу с тем, чтобы более не возвращаться к техническим подробностям, а отмечать лишь некоторые отличия в постановке аналогичных экспериментов другими авторами.

Авторы следующей работы [Whittaker, Moss, 1981] сконструировали еще более простой прибор для электрофореза (рис.

Быть может, это связано с тем обстоятельством, что авторы использовали пластинку волокнистой, а не микрокристаллической целлюлозы.

Интересна модификация процедуры фракционирования, которая, по утверждению авторов, заметно улучшает форму пятен.

По мнению авторов, важно строго придерживаться оптимального режима сушки пластинки после электрофореза (в их опытах — 20 мин при 50°, а затем 10 мин при комнатной температуре).

Липофильные белки из культуры клеток зародыша цыпленка (экстрагированные смесью хлороформа с метанолом) авторы успешно фракционировали двумерной ТСХ на пластинках силикагеля, использовав для элюции в первом направлении смесь хлороформ—метанол—вода (65 : 25 : 4).

Сходная методика была использована теми же авторами при выяснении точек повреждения ДНК мутагенами и канцерогенами, химически модифицирующими нуклеиновые основания [Randerath el al.

, 1974] была дана улучшенная рецептура элюентов для ТСХ нуклеозидов на волокнистой целлюлозе типа MN300, которой авторы отдают предпочтение перед микрокристаллической.

Правда, при этом авторам приходилось наносить на пластинку (в пятне диаметром 1,5 см) 2—3 оптические единицы, т.

С тех пор метод эволюционировал; особенно плодотворным оказалось введение теми же авторами для разделения во втором направлении хроматографии на пластинках ДЭАЭ-целлюлозы с элюцией так называемой «гомосмесью» («гомохроматография»).

В то время выпускались пластинки размером 20 X 20 см, и авторы вынуждены были удлинять их, пришивая фитили из фильтровальной бумаги (кончик фитиля выступал из банки); сейчас же выпускаются пластинки размером 20 X 40 см.

В рассмотренных ниже работах Зильберкланга и соавторов по секвенированпю тРНК с использованием описываемого способа двумерного фракционирования олигонуклеотидов, а также в совсем недавних работах других авторов [Goldenberg et al.

Хроматографию вели при 65°, хотя авторы указывают на то, что ее можно вести и при комнатной температуре, удвоив время элюции.

Авторы разделяли олигонуклео-тиды вида (Ap)nCp, (Ap)nUp и (Ap)raGp.

Авторы предлагают вести разделение в первом направлении на пластинке PEI-целлюлозы без флюорогена, а затем переносить материал на пластинку с флюорогеном.

, 1980] авторы кардинальным образом пересмотрели свою методику, перейдя в соответствии с «духом времени» на метку радиоактивным фосфором, вводимую с помощью Т4-полинуклеотидкиназы.

Авторы сопоставили результаты аминокислотного анализа не только чистых белков, но и различных кормов с высоким содержанием углеводов при использовании такого режима и традиционным методом (110°; 24 ч); результаты оказались примерно одинаковыми.

Авторы цитируемой работы не упоминают о степени вязкости исходного препарата, что в случае внесения на колонку непосредственно клеточного лизата представляет интерес, тем более что элюцию вели с довольно большой скоростью — около 12 мл/см2-ч.

Автор сопоставлял молекулярные массы a-белка из клеток HeLa и гонадотропина из мочи человека (надо отдать ему должное: определяемые значения молекулярных масс он называет «кажущимися» — «apparent»).

Для построения калибровочного графика авторы использовали шесть известных по составу пептидов неполного бромцианового гидролизата цитохрома с из сердца лошади.

78 показана полученная авторами зависимость.

Авторы использовали колонку размером 1,5^х 90 см, а элюцию вели 6 М раствором гуанидинхлорида в 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 7.

Printed with FmePrmt-purc ности (калибровочную прямую) эти авторы предпочли строить в координатах log (100 К(1) и N /3.

Авторы сообщили об успешном разделении классического набора стандартных белков (БСА, овальбумин, химотрипсиногеп, лизоцим, цитохром с), о линейной зависимости log M от VR и подчеркнули, что все фракционирование у них занимало 6 мин.

Имеется ли выигрыш в эффективности разделения фракций, который можно ожидать от ЖХВД, или авторы пожертвовали им ради скорости процесса?

Авторы резонно замечают, что эксклюзия нативных белков зависит от их формы (у них альбумин с М = 69 000 намного опережал гемоглобин с М — 68 000) и что следует переходить на гель-фильтрацию денатурированных белков [Wehr, Abbott, 1979].

Авторы обнаружили, что объем элюции для каждого белка увеличивается с ростом концентрации элюирующего фосфатного буфера (от 0,02 до 0,2 М) и тем сильнее, чем меньше молекулярная масса белка.

Автор указывал, что этот эффект обусловлен гидрофобным взаимодействием фракционируемых молекул с материалом матрицы, которое усиливается в присутствии фосфата.

Обследовав поведение ряда нативных белков, авторы нашли, что для некоторых из них объем элюции сильно зависит от рН.

В качестве ионогенных групп матрицы, по мнению авторов, выступают депротонированные сила-вольные группы =8Ю (рК„ = 6,8).

Авторы наблюдали еще более сильно выраженные эффекты.

Кстати, и сам автор отмечает, что при увеличении концентрации соли порядок элюции определяется уже не молекулярными массами, а стоксовыми радиусами белковых молекул.

Авторы подавляли его введением в элюент и-пропанола (0,36 М формиат пиридина, рН 5, и и-пропанол в соотношении 3 : 1).

Авторы вели гель-фильтрацию под высоким давлением на четырех последовательно соединенных колонках только что упомянутого типа, но с различной пористостью: за колонкой «Protein Column I-60* следовали две колонки 1-125, а замыкала этот «тандем» колонка типа 1-250 (диапазоны фракционирования — соответственно 1—20, 2—50 и 10—500 тыс.

Здесь нас интересует не вариант последовательного включения колонок разной пористости (у нас нет достаточных данных для его оценки), а то обстоятельство, что для элюции авторы использовали (из-за его летучести) довольно гидрофобный триэтиламиноформиатный буфер в концентрации 0,2 М.

Однако это вряд ли целесообразно, так как в большинстве случаев авторы ставят перед собой одну и ту же (на наш взгляд, не самую важную для биохимика) задачу — провести процесс гель-фильтрации белков или НК с максимальной скоростью, не очень заботясь о повышении его эффективности.

Позже те же авторы описали фракционирование гель-фильтрацией на двух соединенных последовательно колонках типа «Ultropac TSK G 3000 SW» и «.

Авторы работы строили зависимость log M от RF (а не от I/RF), однако для 13 известных им пептидов и 5 гликопептидов нашли примерно линейную зависимость (чем больше log M , тем больше, т.

Авторы использовали ыатнвные белки и мягкие условия хроматографии.

Авторы замечают, что в отличие от фрагментов, экстрагируемых после электрофореза из ПААГ или гелей агарозы, здесь нет примесей, ингибирующих ферменты последующей обработки ДНК,— фосфатазу, обратную транскриптазу, полинуклеотидкиназу и рестриктазы [Bina et al.

Авторы указывают, что этот метод позволяет успешно разделять однонитевые фрагменты ДНК и РНК градиентом 0,1-lM KC1 в 12 мМ NaOH (рН 12), многочисленные рестриктные фрагменты ДНК в аналитическом и препаративном вариантах, как было описано выше (причем даны подробные рекомендации), комплементарные нити даже небольших фрагментов ДНК в щелочной среде путем элюции пологим градиентом КС1.

Авторы называют следующие ближайшие перспективы фракционирования ДНК в системе ХОФ-5:

Даже если отнестись к оптимизму авторов с некоторой осторожностью, ясно, что метод фракционирования в системе ХОФ-5 в связи с исследованиями ДНК переживает сейчас свое второе рождение [Wells et al.

Здесь авторы использовали известный факт повышенного содержания ГЦ-пар в этих генах.

Примерно в то же время метод был использован другой группой авторов для фракционирования 700 мг тРНК на колонке размером 2,3 X 75 см [Colantuoni et al.

Интересно отметить, что выбранная автором начальная концентрация СА (50% от насыщающей) в свободном растворе еще не высаливает белки.

Гидрофобные матрицы авторы синтезировали сами путем присоединения различных алкил-аминов к BrCN-активированной агарозе.

, 1979], авторы которой сопоставляли различные варианты очистки цитохром-с-оксидазы методом гидрофобной обратнофазовой хроматографии.

Любопытно, что на заключительном этапе очистки авторы этой работы проводили хроматографию на аминогексилагарозе, которая используется как ионообмен-ник.

Авторы данной работы обратили внимание на то, что в продажной октилсефарозе CL-4B фирмы «Pharmacia» имеются какие-то особо гидрофобные примеси.

Авторы рекомендуют предварительно насытить эту гипергидрофобную функцию матрицы, внося на нее бактериальный экстракт в присутствии 30% ЭГ и элюируя его затем 90%-ным раствором ЭГ.

Для разделения указанных пар аминокислот авторы использовали другую, более гидрофобную матрицу «f.

Авторы недавно опубликованной работы сообщают, что в найденных ими условиях данзилирования высокий выход реакции (90— 100%) одинаков для всех аминокислот и не зависит от соотношения концентраций вплоть до 1000-кратного избытка данзилхлорида [Та-puhi et al.

Испробовав различные сорбенты для ХОФ, авторы остановились на колонке «Aquapore RP-300» фирмы «Brownlee Labs».

Авторы использовали хроматограф фирмы «Waters» с программным устройством (модель 660).

Авторы утверждают, что оно отлично воспроизводится [Fohlman et al.

Повышение температуры авторы обосновывают относительно высокой вязкостью этанола.

Авторы подчеркивают необходимость тщательной очистки реагентов.

Для указанных условий автор приводит таблицу слагаемых времен задержания за счет каждой аминокислоты.

Авторы исследования отдают предпочтение сорбенту «|j,-Bon-dapak-Phenyl» при ион-парной хроматографии.

Авторы приходят к выводу, что два метода дополняют друг друга.

Авторы тщательно отработали условия эксперимента, позволившего им в ходе одного хроматографи-ческого фракционирования на колонке «Supelco C18» за 48 мин разделить 29 минорных нуклеозидов из тРНК бактериального происхождения.

Авторы утверждают, что в аналогичной системе можно фракционировать и гомоолигонуклеотиды вида (Np)nN вплоть до п = 11.

Те же авторы предложили аналогичную систему изократического фракционирования ряда модифицированных «минорных» нуклеозидов и дезоксирибонуклеозидов.

Дальтон автор отдает предпочтение силикагелям, модифицированным октилсиланом (С8).

Рассматривая важную проблему денатурации белков в процессе хроматографии, авторы отмечают, что опасность связана не столько с относительно кратковременным пребыванием белка в водно-органическом растворителе, сколько с самим актом гидрофобного взаимодействия белка с матрицей.

Подфракции пяти основных гистонов разделились лучше, чем при электрофорезе, однако их выход, по данным авторов, был далеко не полным.

Printed with FmePrmt-purc ные силанольиые группы блокированы при изготовлении; кроме того, авторы применили вариант ион-парной хроматографии, осуществляя элюцию градиентом концентрации ацетонитрила (20— 60%) в 0,3%-ном растворе трифторуксусной кислоты.

Несколько усложнив характер элюции ацетонитрилом (комбинация выпуклого и линейного градиентов с изокрэтическими участками) в присутствии 0,1%-ной ТФУ и заменив сорбент на «Synchropak RP-Ci8», те же авторы сумели получить 17 хроматографических пиков для малой субъединицы рибосом Е.

95, б) авторы усматривают суперпозицию четырех пиков, обозначенных а — d.

Авторы рассмотренной работы предпочли вести фракционирование белков сравнительно небольшого размера на умеренно гидрофобном сорбенте с восьмиуглеродной цепочкой модификатора (С«).

Этих авторов особенно интересовала полнота выхода фракционируемых белков из-за возможности очень прочного гидрофобного взаимодействия их с сорбентом.

Авторы приходят к заключению, что хроматографию белков следует вести на сорбентах с трехуглеродиыми алифатическими модификаторами (С3).

По такому пути пошли, например, авторы работы, посвященной фракционированию некоторых ферментов биосинтеза фе-нильных производных из растений.

Авторы всех рассмотренных в этом разделе работ пользовались стандартными продажными сорбентами с размером пор 60— 100 А.

Авторы отмечают высокую избирательность хроматографии.

Для адекиатности сопоставления модификацию различных продажных си-ликагелсй октилдиметилхлорсиланом авторы производили сами, в одинаковых условиях.

По данным автора, разделение идет по длине фрагментов, так что эту длину можно определять с помощью калибровочной кривой, построенной по результатам хроматографии известных рестриктных фрагментов ДНК [Usher, 1979].

Представляет интерес замеченная авторами необходимость увеличения концентрации элюирующего фосфатного буфера для снятия с колонки оксиапатита кислых белков при увеличении длины колонки.

Автор отмечает, что физико-химические и биологические свойства нативной ДНК в ходе хроматографии не изменяются.

В случае фрагментированной ДНК из плаценты длиной около 500 пар оснований авторы регистрировали различие в прочности сорбции правельных двунитевых структур с температурой плавления 84° и несовершенных структур с неточным спариванием нитей, температура плавления которых составляла соответственно 77° и 70°.

По данным авторов, ее выход сильно варьировал от одной партии оксиапатита к другой.

Авторы использовали посадку смеси фрагментов на оксиапатит в воде и элюцию линейным градиентом концентрации фосфатного буфера (О—0,1 М — для очень коротких фрагментов, 0—0,35 М — для более длинных).

В недавно опубликованной работе по кинетике ренатурации ДНК человека и мыши авторы предпочли К-фосфат-ный буфер и несколько иной подход к разделению нативной и денатурированной ДНК.

Авторы утверждают, что разделение денатурированной и нативной ДНК в этом случае осуществляется более надежно [Soriano et al.

Авторы элюировали белки со стекла растворами NaCl и щелочным буфером.

Сопоставление профилей разделения белков сыворотки крови и гемоглобинов на различных слабых анионитах позволяет авторам сделать заключение о преимуществе нового обменника [Kato et al.

Авторы отмечают, что элюция изменением только ионной силы (при постоянном рН) дает более широкие пики и худшее разрешение [Huang et al.

Недавно группа японских авторов описала фракционирование 1 мг трипсинового гидролизата кальмодулина из мозга быка на «макроретикулярной» полистирольной анионообмен-ной смоле «Diaion CDR-10» (Япония) с диаметром зерен 5—7 мкм.

Несмотря на лабильность фермента, авторам удалось на этом этапе получить 100%-ный выход его по активности при очистке в 45 раз.

Автор последовательно использовал три этапа хроматографической очистки: на фосфоцеллюлозе с элюцией линейным градиентом концентрации GA (0,075—0,5 М), на DEAE-сефадексе и DEAE-целлюлозе с элюцией в обоих случаях также линейным градиентом концентрации GA (0,05—0,5 М).

Авторам удавалось перевести более 95% хроматина в раствор путем дробления его во Фрэнч-прессе, за которым непосредственно и следовала ионообменная хроматография.

Авторы полагают, что в хроматине из ядер печени рано элюируемый материал обогащен активно транскрибируемыми участками [Smith, Billetl, 1982].

Двумя годами позже эти же авторы описали приготовление анионообменника специально для ЖХВД белков путем ковалент-ной посадки слоя полиэтиленимина (М = 600) на весьма крупнопористые продажные силикагели «Lichrospher Si 1000» и «Lichros-pher Si 4000».

Недавно группой авторов с участием Регниера была предложена методика приготовления слабого катионообменника для ЖХВД белков на основе крупнопористого силикагеля («Vydac TP 201»; 300 А).

Получается жесткий, крупнопористый обменник для ЖХВД, названный авторами «CM-polyamide column».

Авторы объясняют это лучшей кинетикой десорбции, что в условиях быстро протекающего процесса ЖХВД может иметь существенное значение [Kopaciewicz, Reg-nier, 1983].

Влияние гидрофобных взаимодействий авторы подавляли, вводя в элюент 20% этанола и проводя элюцию при температуре 70° [Demushkin, Plyashkevich, 1978].

Авторы отмечают, что в отличие от рекомендаций фирмы элюцию с использованием полибуфера 74 (рН 4) следует начинать не сразу, а после промывки колонки с сорбированным на ней белком тремя объемами исходного буфера.

Авторы нашли, что для воспроизводимости градиентов рН и количественного выхода белка полибуферы предпочтительно титровать не СН3СООН, как рекомендует фирма «Pharmacia», а НС1 [Gysin et al.

Реакция активации с участием триэтиламина (ТЭА), по мнению авторов, идет через образование при рН 7—8 очень реакционноспособного комплекса триэтиламмо-нийннтрила:

По данным авторов, благодаря переходу к нейтральным условиям для получения 10 г сорбента с умеренной активностью требуется всего лишь 30—50 мг BrCN вместо обычных 1—2 г (соответственно уменьшается и степень опасности отравления!

Позднее те же авторы предложили еще один агент для получения активированных эфиром цианата полисахаридов — 1-циан-4-диметиламинопиридин-тетрафторборат [Kohn, Wilchek, 1983].

Другие авторы рекомендуют несколько иное соотношение тех же реагентов [Uy, Wold, 1977].

Преимущества использования в качестве матрицы силикагеля при решении стоявшей перед авторами задачи создания сорбента для очистки протеаз обсуждаются ниже.

В качестве активирующего агента авторы использовали триф-торэтилсульфонилхлорид — торговое название «tresyl chloride» (фирма «Fluka»).

Авторы указывают, что при хранении активированного геля в течение ночи на холоду в 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7,5) инактивация практически не заметна.

Кроме того, авторы проверили прочность посадки белка на активированную трезилхлоридом матрицу.

Годом ранее те же авторы описали аналогичную реакцию активации полисахаридных матриц с помощью другого продажного препарата — ге-толуолсуль-фонилхлорида (торговое название — «tosyl chloride») [Nilsson, Mos-bach, 1980].

Те же авторы описали интересное яв




Главный редактор проекта: Мавлютов Р.Р.
oglib@mail.ru